Bien choisir un microscope

Microscope électronique compact

On distingue trois principaux types de microscopes : optiques, électroniques ou à sonde locale. Voici leurs différences :

• Les microscopes optiques : ils utilisent des lentilles optiques pour former l’image tout en contrôlant le faisceau lumineux pour éclairer l’échantillon. Plusieurs paramètres (type d’éclairage, polarisation, filtrage spectral, filtrage spatial) peuvent être modifiés pour avoir différentes techniques d’observation. Les microscopes numériques sont des sortes de microscopes optiques ou l’oeil de l’observateur est remplacé par une caméra. Les grossissements en microscopie optique sont de l’ordre de 1000x.
• Les microscopes électroniques : l’irradiation de l’échantillon se fait via un faisceau d’électrons. Les grossissements sont ici nettement plus importants qu’en microscopie optique et peuvent atteindre deux millions de fois. Les microscopes électroniques sont principalement de deux sortes : en transmission (TEM) ou à balayage (SEM).
• Les microscopes à sonde locale : ce type de microscopie consiste à approcher une sonde de la surface d’un objet et à déterminer la topographie de la surface d’un échantillon. Selon le microscope utilisé, la résolution spatiale peut atteindre l’échelle atomique. On y retrouve par exemple les microscopes à force atomique (AFM) ou encore les microscopes à champ proche (SNOM).

Dans le domaine de la santé, les microscopes sont utilisés dans de nombreux secteurs tels que :

• Le médical : les microscopes permettent d’effectuer des examens en laboratoire, notamment pour étudier des échantillons et détecter la présence d’agents pathogènes tels que des microbes, des bactéries ou autres micro-organismes mortels. En histopathologie par exemple, les microscopes sont utilisés pour observer des prélèvements de tissus à des fins diagnostiques.
• Les sciences de la vie (biologie) : les microscopes peuvent être employés pour l’étude des micro-organismes, par exemple leur constitution cellulaire et  leurs modes de développement.
• La médecine légale (police scientifique) : les microscopes sont utilisés pour l’analyse des indices retrouvés sur des scènes de crime dans le but de présenter des preuves devant les tribunaux. Des éléments tels que de la poussière, du verre, des bouts de tissus, des fluides corporels, des cheveux, de l’encre et des micro-organismes peuvent être analysés au microscope.
• L’industrie pharmaceutique : les microscopes sont utilisés dans l’industrie pharmaceutique pour assurer la sécurité et la qualité des produits. Les scientifiques analysent les produits au microscope pour déceler tout défaut ou contaminant.
• L’enseignement : de nombreux modèles sont destinés aux salles de travaux pratiques des écoles ou des universités.
• La recherche 

Il existe de nombreuses techniques d’observation en microscopie qui dépendent du type de microscope utilisé et du domaine d’application concerné. Celles qui sont le plus souvent retrouvées sur le marché sont les suivantes.

Exemple d’image par microscopie confocale à balayage laser

En microscopie optique:

• A champ clair (conventionnelle) : technique classique qui permet de recueillir la lumière blanche transmise par l’échantillon. On parle aussi de microscopie à fond clair. Elle ne nécessite pas une grande préparation des échantillons. Par contre, elle a un faible contraste et est inadaptée pour des échantillons épais.
• A champ sombre : ici, la lumière émise par la source est faiblement transmise à l’objectif du microscope. Seule la lumière diffusée par l’échantillon est recueillie par l’objectif du microscope. On parle aussi de microscopie à fond sombre. Elle a pour but d’améliorer le contraste et d’observer les échantillons sans qu’il ne soit nécessaire de les colorer. Elle reste inadaptée pour des échantillons épais.
• A fluorescence : la lumière est émise par les échantillons. Ceux-ci peuvent être naturellement fluorescents ou alors rendus fluorescents. Il s’agit d’une technique très sensible utile pour marquer et différencier plusieurs structures simultanément via leurs couleurs de fluorescence. Elle est aussi efficace pour observer la dynamique biochimique des échantillons.
• Confocale à balayage laser : la source lumineuse utilisée est un laser. Cette technique est très souvent couplée à la microscopie en fluorescence. Elle propose une meilleure résolution, adaptée aux objets épais ou étendus. Elle est aussi efficace pour l’observation fixe ou dynamique (exemple de cellules vivantes). Cependant, le matériel est très coûteux et le laser utilisé présente des risques.

En microscopie électronique:

Image de caillot sanguin par technique SEM

• A balayage (SEM) : un faisceau fin d’électrons est émis sur l’échantillon à observer. Leur interaction entraîne la formation d’électrons secondaires. Ceux-ci sont détectés, convertis en signaux qui permettent de reconstituer l’image en relief avec une grande profondeur de champ.  Néanmoins, la préparation des échantillons est contraignante. Ils doivent être déshydratés puis subir un traitement pour devenir conducteur (fixation des tissus, nettoyage).
• A transmission (TEM) : de façon similaire, un fin faisceau d’électrons est émis sur l’échantillon. Cependant, ici ce sont les électrons ayant traversé l’échantillon qui vont être détectés par le microscope. Ils offrent une meilleure résolution que les microscopes SEM. Les échantillons doivent être préparés selon un protocole précis. Ils doivent à la fois conserver leur structure et être conducteurs pour laisser passer le faisceau d’électrons.

En microscopie à sonde locale:

• A force atomique (AFM) : c’est une technique qui utilise la force de répulsion entre les nuages électroniques de la surface de l’échantillon et le nuage électronique de la sonde du microscope. Cette technique permet donc de balayer la surface d’un échantillon, la sonde pouvant se déplacer dans toutes les directions. L’analyse du parcours de la sonde, ainsi que la mesure des forces d’interactions intervenant entre elle et l’échantillon, permettent de définir la topographie de surface. Elle est applicable à des échantillons conducteurs et non-conducteurs.
• A champ proche (SNOM) : c’est une technique de microscopie de super résolution. En effet, elle permet de dépasser la limite d’Abbe par détection des ondes évanescentes. Le détecteur de lumière est placé très proche de la surface de l’échantillon. Ainsi, on observe l’onde évanescente et non pas l’onde dispersée. On peut donc visualiser des détails plus petits que la longueur d’onde de la lumière.

Vu le grand nombre d’applications pour un microscope, les critères sont très variables selon l’usage final. De façon générale, on choisira son microscope en se fondant sur cinq grandes caractéristiques : le grossissement, la technique d’observation, la configuration, le nombre d’oculaires et le type d’éclairage.

• Le grossissement total du microscope : il s’agit du produit du grossissement des oculaires par celui de l’objectif.

• La technique d’observation microscopique

• La configuration du microscope : la plupart des microscopes sont dits droits, c’est-à-dire que la lumière arrive sur l’échantillon par le bas et l’observation se fait par le dessus. Il existe aussi des microscopes inversés où la source de lumière est placée au-dessus de l’échantillon et les objectifs en dessous.

• Le nombre d’oculaires : il existe des microscopes monoculaires, binoculaires ou trinoculaires.

• Le type d’éclairage : le plus souvent l’éclairage est de type LED ou halogène.

Il existe de nombreux accessoires disponibles et compatibles selon le type de microscopie et le domaine d’application concerné. Cela va des caméras, aux écrans en passant par les zooms.

Voici les accessoires possibles :

• Caméras : les caméras sont montées sur l’objectif et permettent d’effectuer des clichés des échantillons analysés.
• Ecrans : ils permettent d’afficher en temps réel ce qui est observé au microscope pour une facilité d’observation.
• Système de discussion : cet outil permet de diviser le faisceau et de l’afficher dans deux objectifs différents afin que deux utilisateurs puissent observer simultanément l’échantillon.
• Numériseurs de lames : ils permettent de scanner l’échantillon observé et de traiter informatiquement les images recueillies.
• Zoom : le zoom permet d’effectuer un grossissement en continu de l’échantillon observé.
• Système de motorisation : celui-ci est utilisé pour le déplacement du porte-objectifs.